Utilisation de la spectroscopie d'impédance électrochimique pour étudier les biocapteurs électrochimiques à base d'aptamère

Abstract : One of the significant challenges in the healthcare industry is medication errors, which can lead to severe consequences for patients, including adverse drug reactions and even death. Recently, to tackle this issue, personalized medicine solutions are emerging as potential alternatives to improve the efficiency with which drug dosing is achieved. Specifically, these approaches involve tailoring medical treatment to the specific needs of a patient based on their genetics, environments and lifestyles. To achieve true personalized medicine requires the development of analytical methods capable of providing real-time monitoring of molecules. To date, however, current analytical approaches, at best, only provide a single snapshot of one’s health and require venous draws that are sent to external laboratories where trained personnel perform analyses on cumbersome instrumentation. Biosensors, in contrast, can provide continuous and accurate measurements of various biomarkers and can allow for early detections providing information for early intervention. Additionally, biosensors can be used to monitor the efficacy of treatments and adjust medication dosages in real time, which can lead to better therapeutic outcomes. The development of personalized medicine and real-time monitoring sensing platforms has the potential to revolutionize the healthcare industry, providing better patient outcomes and improving the overall efficiency and quality of the healthcare system. Electrochemical aptamer-based (E-AB) sensors have emerged as candidates to develop personalized medicine tools. Being comprised of a redox-reporter-modified short nucleic acid sequence (i.e., aptamer) immobilized on an electrode surface affords real-time and continuous measurements of diverse molecular species, such as proteins, nucleic acids, and small molecules directly in undiluted complex matrices. The flexibility with which aptamers can be swapped in this sensing platform makes them an optimal platform for designing personalized medicine tools for diverse clinical applications. The widespread implementation of E-AB sensors has been hampered by their restricted aptamer affinity (μM−mM range), which falls short of covering the entire range of clinically relevant concentrations at which molecules need to be assessed. In the first part of this memoir, we investigated two electrochemical interrogation techniques, namely, square-wave voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy, in measuring the dissociation constants of E-AB sensors. The results revealed that although square-wave voltammetry has been the most used interrogation technique, it systematically yields aptamers’ dissociation constants higher than ones measured for the same aptamer with other techniques and thus in certain cases leaves E-AB sensors unable to measure the concentration of molecules in the target clinical range. We found that electrochemical impedance spectroscopy, in contrast, proved to be a superior technique due to its ability to deconvolute interfacial resistive and capacitive contributions to the measured current and quantify electrochemical processes occurring on several time scales with higher resolution. When comparing dissociation constants measured via electrochemical impedance spectroscopy with the gold standard method in aptamer characterization isothermal titration calorimetry we found that these were either within experimental errors or only 2−3-fold apart. Therefore, our study proposes that electrochemical impedance spectroscopy is a more reliable and accurate electrochemical technique compared to square-wave voltammetry for interrogating E-AB sensors. In the second part of this memoir, we discovered a new signal transduction mechanism for E-AB sensors which involves the widely used redox reporter methylene blue, which competes with ligand binding. The results demonstrated that methylene blue folds the aptamer we tested and dislodges ligands from its binding pocket. Consequently, the electrochemical properties of methylene blue change, leading to a measurable signal. Given the prevalence of methylene blue in E-AB sensors, this finding challenges the widely accepted conventional "conformational change" mechanism of E-AB sensors and suggests an alternative signal transduction scheme. Our study provides important insights into the underlying physicochemical properties at E-AB sensors’ surface and their fundamentals.L’occurrence d'erreurs médicamenteuses pouvant entraîner des conséquences graves pour les patients (réactions indésirables aux médicaments, décès, etc.) demeure un enjeu de taille pour les soins de santé. Récemment, pour faire face à ce problème, la médecine personnalisée a émergé comme une alternative efficace afin d’améliorer l'efficacité des prescriptions de médicaments. Cette approche consiste à adapter les traitements aux besoins spécifiques d'un patient en fonction de sa génétique, de son environnement et de son mode de vie. Toutefois, pour parvenir à une véritable médecine personnalisée, il est nécessaire de développer des méthodes analytiques capables de fournir un suivi en temps réel des molécules. À ce jour, les approches analytiques actuelles ne permettent au mieux qu'une seule mesure instantanée de l'état de santé et nécessitent des prélèvements veineux envoyés à des laboratoires externes où des professionnels qualifiés effectuent des analyses à l'aide d'instruments encombrants. En revanche, les biocapteurs peuvent fournir des mesures continues et précises de divers biomarqueurs et fournir des informations pour une intervention précoce. De plus, les biocapteurs peuvent être utilisés pour surveiller l'efficacité des traitements et ajuster les doses de médicaments en temps réel, ce qui peut conduire à de meilleurs résultats thérapeutiques. Le développement de la médecine personnalisée et de plateformes de surveillance en temps réel a le potentiel de révolutionner les soins de santé en améliorant la qualité et la qualité de résultats pour les patients. Les biocapteurs électrochimiques à base d'aptamères (E-AB) ont émergé comme des candidats pour le développement d'outils de médecine personnalisée. Composés d'une courte séquence d'acide nucléique spécifique à une cible moléculaire (un aptamère) modifiée par un rapporteur rédox immobilisé sur une surface d'électrode, ces capteurs permettent des mesures en temps réel et continues de diverses espèces moléculaires telles que des protéines, des acides nucléiques et des petites molécules directement dans des matrices complexes non diluées. La flexibilité avec laquelle les aptamères peuvent être échangés dans cette plateforme de détection en fait une plateforme optimale pour la conception d'outils de médecine personnalisée pour diverses applications cliniques. Toutefois, la mise en oeuvre des capteurs E-AB dans diverses applications a été entravée par la faible affinité des aptamères (dans la plage μM−mM), qui ne couvre pas l'ensemble de la plage de concentrations cliniquement pertinente sur laquelle les molécules doivent être quantifiées. Dans la première partie de cette étude, nous avons examiné deux techniques d'interrogation électrochimiques, à savoir la voltampérométrie à onde carrée et la spectroscopie d'impédance électrochimique, pour mesurer les constantes de dissociation des capteurs E-AB. Les résultats ont révélé que, bien que la voltampérométrie à onde carrée soit la technique d'interrogation la plus couramment utilisée, elle produit des constantes de dissociation des aptamères plus élevées que celles mesurées pour le même aptamère avec d'autres techniques, ce qui, dans certains cas, empêche les capteurs E-AB de mesurer la concentration des molécules dans la plage clinique cible. Nous avons constaté que la spectroscopie d'impédance électrochimique, en revanche, s'est révélée être une technique supérieure en raison de sa capacité à déconvoluer les contributions résistives et capacitives interfaciales au courant mesuré et à quantifier les processus électrochimiques se produisant à différentes échelles de temps avec une résolution plus élevée. Lors de la comparaison des constantes de dissociation mesurées par spectroscopie d'impédance électrochimique avec la méthode de référence en caractérisation d'aptamères, le titrage calorimétrique isotherme, nous avons constaté que ces constantes étaient soit dans les limites des erreurs expérimentales, ou différenciées par un facteur de 2 à 3. Par conséquent, notre étude propose que la spectroscopie d'impédance électrochimique soit une technique électrochimique plus fiable et précise par rapport à la voltampérométrie à onde carrée pour l'interrogation des capteurs E-AB. Dans la deuxième partie de cette étude, nous avons découvert un nouveau mécanisme de traduction du signal pour les capteurs E-AB, impliquant le rapporteur rédox largement utilisé, le bleu de méthylène, qui entre en compétition avec la liaison du ligand. Les résultats ont démontré que le bleu de méthylène replie l'aptamère que nous avons testé et déloge les ligands de sa poche de liaison. Par conséquent, les propriétés électrochimiques du bleu de méthylène changent, ce qui entraîne un signal mesurable. Étant donné la prévalence du bleu de méthylène dans les capteurs E-AB, cette découverte remet en question le mécanisme conventionnel largement accepté du "changement conformationnel" des capteurs E-AB et suggère un schéma alternatif de traduction du signal. Notre étude apporte des éclaircissements importants sur les propriétés physico-chimiques sous-jacentes à la surface des capteurs E-AB et leurs fondements

Redox Reporter - Ligand Competition to Support Signaling in the Cocaine-Binding Electrochemical Aptamer-Based Biosensor

Electrochemical aptamer-based (E-AB) biosensors have demonstrated capabilities in monitoring molecules directly in undiluted complex matrices and in the body with the hopes of addressing personalized medicine challenges. This sensing platform relies on an electrode-bound, redox- reporter-modified aptamer. The electrochemical signal is thought to originate from the aptamer undergoing a binding- induced conformational change capable of moving the redox reporter closer to the electrode surface. While this is the generally accepted mechanism, it is notable that there is limited evidence demonstrating conformational change or distance-dependent change in electron transfer rates in E-AB sensors. In response, we investigate here the signal transduction of the well-studied cocaine-binding aptamer with different analytical methods and found that this sensor relies on a redox-reporter - ligand competition mechanism rather than a ligand-induced structure formation mechanism. Our results show that the covalently bound redox reporter, methylene blue, binds at or near the ligand binding site on the aptamer resulting in a folded conformation of the cocaine-binding aptamer. Addition of ligand then competes with the redox reporter for binding, altering its electron transfer rate. While we show this for the cocaine-binding aptamer, given the prevalence of methylene blue in E-AB sensors, a similar competition-based may occur in other systems